超声微泡联合万古霉素对表皮葡萄球菌生物膜的干预作用及机制研究

【摘要】第一部分临床分离表皮葡萄球菌的产生物膜特性及序列分型
【作者】董莹；
【导师】余加林；
【作者基本信息】重庆医科大学，儿科学，2014，博士
【目的】表皮葡萄球菌是医院感染尤其是材料相关性感染的主要致病菌。本研究选取临床分离的表皮葡萄球菌菌株，分析生物膜（biofilm,BF）阳性菌株和BF阴性菌株在表型和基因型上的差别，以说明BF对表皮葡萄球菌致病的重要性。
【方法】收集德国维尔茨堡大学附属儿童医院2013年10月至2014年1月送检静脉导管及血标本中分离出的5株表皮葡萄球菌菌株。VITEK2Compact药敏分析系统分析菌株的耐药谱、刚果红定性实验和结晶紫半定量粘附实验分析菌株的产BF能力、聚合酶链式反应检测菌株的BF相关基因icaA及IS256的表达。采用多位点序列分型技术对菌株进行病原学分型，并将获得的序列型（sequencetype,ST）与表皮葡萄球菌数据库的eBURST遗传进化图进行对照。
【结果】BF阳性菌株与阴性菌株在表型及基因型上存在明显差别。同BF阴性菌株相比，BF阳性菌株耐药谱更广、对材料表面的粘附力更强。病原学分型显示BF阳性菌株与BF阴性菌株分别属于ST2和ST10，前者基因icaA和IS256的表达水平高于后者。eBURST遗传进化图显示ST2是全球多地传播的表皮葡萄球菌的源ST。
【结论】BF阳性菌株因其特殊表型和遗传变异性，能有效抵御来自医院环境的不良应激因素，成为医院感染的主要致病菌。第二部分超声微泡干预表皮葡萄球菌BF的体外实验装置的建立
【目的】建立一种超声微泡干预表皮葡萄球菌BF的体外实验装置。
【方法】采用表皮葡萄球菌标准菌株ATCC35984（RP62A），稀释平板计数法绘制菌液浓度与光密度值的标准曲线。将10ml接种菌液注入OpticellTM1100细胞培养装置中建立表皮葡萄球菌BF体外模型，快速银染法及扫描电镜鉴定BF的形成。采用超声振荡法制备超声微泡，微泡注入OpticellTM内腔后将OpticellTM倒置于超声水箱中，超声波经脱气水、聚苯乙烯薄膜及培养基作用于紧密接触的微泡层和BF层。
【结果】表皮葡萄球菌菌液浓度与光密度值呈线性相关，接种菌液浓度约为每毫升2×108集落形成单位（colonyformingunit,CFU）。超声振荡法制备的脂质微泡浓度约1.2×109/ml，直径为4-6μm。OpticellTM装置可用于体外培养细菌BF，以OpticellTM为基础组建的超声水箱系统减少了超声波的衰减，同时BF层和微泡层紧密接触、使实验的准确性显著提高。
【结论】本部分实验利用传统的细胞培养装置OpticellTM成功的建立了一种有效的用超声微泡干预表皮葡萄球菌BF的体外实验装置。第三部分超声微泡联合万古霉素对表皮葡萄球菌BF的协同杀菌作用
【目的】以BF为研究对象进行抗生素药敏试验，探讨超声微泡与万古霉素之间是否存在协同杀菌作用。
【方法】在OpticellTM装置中培养表皮葡萄球菌BF，采用稀释平板计数法检测空白对照组、单独超声组、单独微泡组、超声+低浓度微泡（1%,v/v）组及超声+高浓度微泡（4%,v/v）组中BF活菌数量的差异。微量肉汤稀释法测定万古霉素对浮游细菌的最小抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration,MIC），并以细菌BF为研究对象测定万古霉素在上述不同干预方式下的最小生物膜抑制浓度（biofilminhibitoryconcentration,BIC）。
【结果】空白对照组BF中的活菌数为8.028±0.043log10CFU/cm2，在无抗生素作用时超声+低浓度微泡对BF细菌无显著杀灭作用（8.041±0.049log10CFU/cm2），而超声+高浓度微泡能减少BF中的活菌数量至7.949±0.012log10CFU/cm2（P<0.05）。万古霉素对浮游细菌的MIC为2μg/ml，对细菌BF的BIC为512μg/ml，单纯超声可将BIC降至128μg/ml，而超声+微泡能进一步降低BIC至16μg/ml，超声微泡对万古霉素的协同杀菌效应与微泡浓度呈正相关。
【结论】BF细菌对万古霉素的抵抗性较浮游细菌高数百倍，超声介导下的微泡能协同万古霉素发挥杀菌作用。第四部分超声微泡联合万古霉素对表皮葡萄球菌BF体外干预作用的定性与定量分析
【目的】探讨超声微泡联合万古霉素对体外表皮葡萄球菌BF的活菌数量、结构和形态的影响。
【方法】OpticellTM装置培养表皮葡萄球菌BF，设空白对照组、单独微泡组、单独超声组、超声+微泡组、单独万古霉素组、微泡+万古霉素组、超声+万古霉素组及超声+微泡+万古霉素组，微泡浓度包括低浓度（1%,v/v）和高浓度（4%,v/v）两个参数。超声工作频率为300KHz、能量为0.5W/cm2、脉冲周期为1:1、工作时间为5min。万古霉素的干预浓度为32μg/ml，干预时间为24小时。分别采用平板计数法、扫描电镜（scanningelectronmicroscopy,SEM）及激光共聚焦显微镜（confocallaserscanningmicroscopy,CLSM）分析各干预组中BF的活菌数量及形态结构。
【结果】在无超声介导时脂质微泡本身无杀菌作用。与空白对照组比较，超声+万古霉素能显著减少BF中的活菌比例至38.98%±3.95%（P<0.05），加入微泡后该杀菌效应进一步增强，且高浓度微泡的杀菌作用较低浓度微泡更为显著（6.10%±1.31%vs22.29%±2.99%,P<0.05）。在所有干预方式中，超声+微泡+万古霉素对BF结构的破坏作用最大，能显著减少BF的厚度、增大BF孔径并使BF的三维结构趋于简单。扫描电镜观察到超声+微泡干预后BF中部分细菌被破坏，可见团块状细菌残骸，经高浓度超声微泡作用后的BF中细菌残骸较低浓度超声微泡组增多。
【结论】超声介导下的微泡能破坏表皮葡萄球菌BF的形态和结构，进而增强万古霉素对BF的杀菌作用。第五部分超声微泡干预表皮葡萄球菌BF的物理及生化机制
【目的】从物理作用及生化作用两个方面对超声微泡产生声生物效应的机制进行探讨。
【方法】OpticellTM装置培养表皮葡萄球菌BF，采用激光共聚焦显微镜（confocallaserscanningmicroscopy,CLSM）定性观察经超声+微泡干预后BF细菌对大分子荧光染料的摄取情况，以间接证实“声致穿孔效应”。超声或超声+微泡干预BF后，纸片扩散法测定12h内BF胞外基质对万古霉素分子的通透性的变化趋势。设空白对照组、单独超声组、超声+低浓度微泡组（1%,v/v）、超声+高浓度微泡组（4%,v/v）、单独万古霉素组、超声+万古霉素组、超声+低浓度微泡+万古霉素组及超声+高浓度微泡+万古霉素组，采用实时荧光定量PCR法测定表皮葡萄球菌BF调控系统的重要基因agrB、RNAⅢ和icaA在不同干预组中的mRNA表达情况。
【结果】空白对照组中大分子荧光染料不易通过细菌胞膜，CLSM下仅见稀疏点状荧光。经超声+微泡干预后胞膜通透性增大使得较多荧光染料分子进入胞内，且染料的胞内转运与微泡浓度相关。BF为影响万古霉素分子通过聚苯乙烯薄膜的限速步骤，有BF的聚苯乙烯膜与空白聚苯乙烯膜在第12h末通过的抗生素量分别为负荷量的41.47%±1.6%和64.57%±4.19%（P<0.05），予以超声+微泡干预后通过BF的抗生素量在所有时间点均显著增加，且该促渗效应较单独超声干预更强。单独万古霉素干预后agrB和RNAⅢ两个基因的表达量分别为空白对照组的1.12倍及1.25倍（P<0.05），同时icaA基因的表达量下降至空白对照组的0.87（P<0.05）。与空白对照组比较，超声+高浓度微泡+万古霉素使agrB和RNAⅢ两个基因的表达水平分别增加至空白对照组的1.40倍及1.35倍（P<0.05），同时icaA基因的表达量下降至空白对照组的0.67（P<0.05）。超声+微泡+万古霉素组较超声+万古霉素组对基因agrB和RNAⅢ的上调作用以及对icaA的抑制作用更加显著（P<0.05）。
【结论】超声微泡可增加细菌胞膜及BF胞外基质对万古霉素分子的通透性，同时还可干扰BF的信号调控系统，使BF相关基因agrB和RNAⅢ的表达上调、icaA的表达下调。在超声微泡干预细菌BF的过程中物理机制与生化机制共同参与，协同万古霉素发挥杀菌作用。第六部分超声微泡联合万古霉素对表皮葡萄球菌BF的体内干预作用
【目的】建立动物皮下内置材料表面BF相关性感染的体内模型，探讨超声微泡联合万古霉素对体内表皮葡萄球菌BF的干预作用。
【方法】将长有表皮葡萄球菌BF的聚四氟乙烯导管植入实验兔脊柱两侧的皮下隧道内，采用自身对照法设置空白对照组、单独超声组、超声+微泡组、万古霉素组、超声+万古霉素组及超声+微泡+万古霉素组。干预结束后处死动物，将皮下植入材料取出，采用扫描电镜（scanningelectronmicroscopy,SEM）观察不同干预组中导管表面的BF、稀释平板法测定BF中的活菌数，并对植入材料周围的皮下组织行病理组织学检查。
【结果】导管在植入动物皮下前菌荷量为7.284±0.032log10CFU/catheter。空白对照组、单独超声组、超声+微泡组、万古霉素组、超声+万古霉素组及超声+微泡+万古霉素组中BF活菌数分别为6.436±0.033log10CFU/catheter、6.464±0.066log10CFU/catheter、6.440±0.048log10CFU/catheter、5.395±0.032log10CFU/catheter、5.152±0.035log10CFU/catheter及3.493±0.021log10CFU/catheter，同超声+万古霉素组相比，超声+微泡+万古霉素的杀菌作用更为显著（P<0.05）。SEM见万古霉素干预后BF结构变得疏松、细菌数量减少，单独超声+万古霉素可破坏BF的三维结构，仅余不规则分布的细菌团块，超声+微泡+抗生素组中仅见散在分布的数个细菌。病理组织学检查提示超声微泡联合万古霉素作用后可使动物皮下内置材料周围的炎症反应减轻，且未对正常皮下组织造成明显损伤。
【结论】本部分实验通过建立实验兔皮下内置材料表面BF相关性感染的体内模型，显示超声微泡在体内也可协同万古霉素发挥抗BF效应，并能减轻植入材料周围的炎症反应。
【关键词】表皮葡萄球菌；医院感染；生物膜；多位点序列分型；超声微泡；超声；微泡；万古霉素；微生物敏感性试验；激光共聚焦显微镜；扫描电镜；抗生素转运；基因转录；动物疾病模型；

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